1. Classificação
A eletroforese em gel é dividida em tipos verticais (incluindo géis de coluna e géis de placa) e tipos horizontais (principalmente géis de placa) (Figura 6-18). Geralmente, a separação vertical é ligeiramente superior à horizontal, mas a preparação do gel horizontal apresenta pelo menos quatro vantagens: há suporte abaixo de todo o gel, permitindo o uso de agarose em baixa concentração; é possível preparar placas de gel de agarose de diferentes especificações; a preparação do gel e o carregamento da amostra são mais convenientes; a câmara de eletroforese é fácil de construir e econômica. Como a eletroforese horizontal é realizada com a placa de gel de agarose totalmente submersa cerca de 1 mm abaixo da superfície do tampão de eletroforese, ela também é chamada de eletroforese submersa.
Tanque de eletroforese DYCP-31DN para eletroforese em gel de agarose
2. Sistema de buffer
Na separação de ácidos nucleicos, a maioria dos sistemas adota sistemas contínuos. Os tampões de eletroforese comumente usados incluem tampão TBE (0,08 mol/L Tris·HCl, pH 8,5, 0,08 mol/L ácido bórico, 0,0024 mol/L EDTA) e THE (0,04 mol/L Tris·HCl, pH 7,8, 0,02 mol/L acetato de sódio, tampão EDTA 0,0018mol/L). Esses tampões são geralmente preparados como soluções estoque 10x e diluídos na concentração necessária quando em uso. As taxas de migração de DNA linear e circular em gel de agarose variam com o tampão utilizado. No tampão THE, a taxa de migração do DNA linear é maior que a do DNA circular, enquanto no tampão TBE o oposto é verdadeiro.
3.Preparação de Gel de Agarose
(1) Preparação de Gel de Agarose Horizontal
(a) Prepare a concentração necessária de gel de agarose usando tampão de eletroforese 1x.
(b) Aqueça a agarose até completar a dissolução em banho-maria fervente, em agitador magnético ou em microondas. Arrefecer a solução de agarose a 55°C e adicionar corante de brometo de etídio (EB) até uma concentração final de 0,5 μg/ml.
(c) Sele as bordas das placas de vidro ou acrílico com uma pequena quantidade de gel de agarose, adicione um pente e posicione os dentes do pente cerca de 0,5~1,0 mm acima da placa.
(d) Despeje a solução de gel de agarose derretida continuamente no molde de placa de vidro ou acrílico (a espessura depende do volume da amostra de DNA), evitando a introdução de bolhas de ar. Deixe solidificar naturalmente à temperatura ambiente.
(e) Remova cuidadosamente o pente após a solidificação completa. Adicione uma quantidade adequada de tampão de eletroforese ao tanque de gel, garantindo que a placa de gel esteja submersa cerca de 1 mm abaixo da superfície do tampão de eletroforese.
(2) Preparação de Gel de Agarose Vertical
(a) Remova graxa ou resíduos das placas de vidro lavando com etanol.
(b) Coloque placas espaçadoras entre as barragens frontal e traseira, alinhe as bordas das placas espaçadoras com as barragens frontal e traseira e fixe-as com grampos.
(c) Adicione 2% de agarose em tampão 1x entre as bordas das placas espaçadoras para formar um tampão de agarose de 1 cm de altura no fundo da câmara de fundição de gel.
(d) Despeje o gel de agarose derretido na concentração desejada, preparado em tampão 1x, na câmara de gel até 1 cm abaixo do topo.
(e) Insira o pente, evitando a retenção de bolhas de ar sob os dentes do pente. Às vezes, podem aparecer rugas nos dentes do pente durante o resfriamento do gel de agarose; nesses casos, basta adicionar um pouco de agarose derretida por cima para solidificá-la.
(f) Remova o pente. Para evitar fugas de tampão na ranhura de carregamento, sele a ligação entre a placa de gel de agarose e a câmara de electroforese com 2% de agarose e adicione a quantidade necessária de tampão.
(g) Adicione 1x tampão de eletroforese à câmara de gel.
(h) Carregue cuidadosamente amostras de DNA no gel de agarose abaixo do tampão.
Mais informações sobre os conhecimentos básicos sobre eletroforese em gel de agarose, compartilharemos na próxima semana. Desejo que essas informações sejam úteis para sua experiência.
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Horário da postagem: 07 de dezembro de 2023