Preparação de Amostras eCarregando
Devido ao uso de um sistema tampão contínuo sem gel de empilhamento na maioria dos casos, as amostras devem ter uma concentração adequada e um volume pequeno. Use umpipetaadicionar lentamente a amostra, com 5-10 μg por poço, para evitar uma diminuição significativa na resolução. Quandocarregando amostra, a fonte de alimentação deve ser desligada. A amostra deve conter um corante indicador (0,025% azul de bromofenol ou laranja) e sacarose (10-15%) ou glicerol (5-10%) para aumentar sua densidade, concentrar a amostra e evitar a difusão. No entanto, às vezes a sacarose ou o glicerol podem causar faixas em forma de U nos resultados da eletroforese, o que pode ser evitado usando Ficoll 2,5% (polivinilpirrolidona).
Eletroforese
A voltagem para eletroforese é de 5-15 V/cm, geralmente em torno de 10 V/cm. Para a separação de moléculas grandes, a tensão deve ser menor, geralmente não ultrapassando 5 V/cm.
Coloração
O corante fluorescente brometo de etídio (EB) é comumente usado para coloração para observar bandas de DNA em gel de agarose. O EB pode inserir-se entre pares de bases de moléculas de DNA, fazendo com que o EB se ligue ao DNA. A absorção da luz ultravioleta de 260 nm pelo DNA é transferida para o EB, e o EB ligado emite fluorescência a 590 nm na região vermelho-laranja do espectro de luz visível. A coloração do gel em uma solução de 1 mmol/L de MgSO4 por 1 hora pode reduzir a fluorescência de fundo causada pelo EB não ligado, facilitando a detecção de pequenas quantidades de DNA.
O corante EB tem diversas vantagens: é fácil de usar, não quebra os ácidos nucléicos, tem alta sensibilidade e pode corar DNA e RNA. O EB pode ser adicionado à amostra e rastreado usando absorção UV a qualquer momento. Após a coloração, o EB pode ser removido por extração com n-butanol.
Entretanto, o corante EB é um potente mutagênico e precauções, como o uso de luvas de polietileno, devem ser tomadas durante o manuseio. O laranja de acridina também é um corante comumente usado porque pode diferenciar entre ácidos nucleicos de fita simples e de fita dupla (DNA, RNA). Exibe fluorescência verde (530 nm) para ácidos nucleicos de cadeia dupla e fluorescência vermelha (640 nm) para ácidos nucleicos de cadeia simples. Além disso, outros corantes como azul de metileno, verde de metileno e quinolina B podem ser usados para coloração.
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Horário da postagem: 20 de dezembro de 2023