O Ensaio Cometa (Eletroforese em Gel de Célula Única, SCGE) é uma técnica sensível e rápida usada principalmente para detectar danos e reparos no DNA em células individuais. O nome “Comet Assay” vem do formato característico de cometa que aparece nos resultados: o núcleo da célula forma a “cabeça”, enquanto os fragmentos de DNA danificados migram, criando uma “cauda” semelhante a um cometa.
Princípio
O princípio do Ensaio Cometa é baseado na migração de fragmentos de DNA em um campo elétrico. O DNA intacto permanece dentro do núcleo da célula, enquanto o DNA danificado ou fragmentado migra em direção ao ânodo, formando a “cauda” do cometa. O comprimento e a intensidade da cauda são diretamente proporcionais à extensão do dano ao DNA.
Procedimento
- Preparação Celular: As células a serem testadas são misturadas com agarose de baixo ponto de fusão e espalhadas em lâminas de microscópio para formar uma camada uniforme.
- Lise Celular: As lâminas são imersas em solução de lise para remover a membrana celular e a membrana nuclear, expondo o DNA.
- Eletroforese: As lâminas são colocadas em uma câmara de eletroforese em condições alcalinas ou neutras. Fragmentos de DNA danificados migram em direção ao eletrodo positivo sob a influência do campo elétrico.
- Coloração: Após a eletroforese, as lâminas são coradas com um corante fluorescente (por exemplo, brometo de etídio) para visualizar o DNA.
- Análise Microscópica: Usando um microscópio de fluorescência ou software especializado, os formatos dos cometas são analisados e parâmetros como comprimento e intensidade da cauda são medidos.
Imagem do biorender
Análise de dados
Os resultados do Comet Assay são avaliados com base em vários parâmetros principais:
- Comprimento da cauda: Representa a distância que o DNA migra, indicando a extensão do dano ao DNA.
- Conteúdo de DNA da cauda: A porcentagem de DNA que migra para a cauda, frequentemente usada como medida quantitativa de danos ao DNA.
- Momento da cauda verde-oliva (OTM): Combina o comprimento da cauda e o conteúdo do DNA da cauda para fornecer uma medida mais abrangente dos danos ao DNA.
Aplicativos
- Estudos de Genotoxicidade: O Ensaio Cometa é amplamente utilizado para avaliar os efeitos de produtos químicos, drogas e radiação no DNA celular, tornando-o uma ferramenta fundamental para testes de genotoxicidade.
- Toxicologia Ambiental: Ajuda na análise do impacto dos poluentes ambientais no DNA dos organismos, fornecendo informações sobre a segurança dos ecossistemas.
- Pesquisa Médica e Clínica: O Comet Assay é usado no estudo de mecanismos de reparo de DNA, câncer e outras doenças relacionadas ao DNA. Também avalia o impacto das terapias contra o câncer, como radioterapia e quimioterapia, no DNA.
- Ciências Alimentares e Agrícolas: Usado para avaliar a segurança de pesticidas, aditivos alimentares e outras substâncias e para estudar seus efeitos tóxicos em modelos animais.
Vantagens
- Alta Sensibilidade: Capaz de detectar baixos níveis de danos no DNA.
- Operação Simples: A técnica é simples, tornando-a adequada para triagem de alto rendimento.
- Ampla aplicação: Pode ser aplicado a vários tipos de células, incluindo células animais e vegetais.
- Desafios de quantificação: Embora forneça dados qualitativos sobre danos no DNA, a análise quantitativa depende fortemente de software e técnicas de análise de imagem.
- Condições Experimentais: Os resultados podem ser influenciados por fatores como tempo de eletroforese e pH, exigindo um controle cuidadoso das condições experimentais.
Limitações
O Comet Assay é uma ferramenta inestimável em pesquisa biomédica, ciência ambiental e desenvolvimento de medicamentos devido à sua flexibilidade e alta sensibilidade na detecção de danos e reparos no DNA. Pequim Liuyi Biotecnologia Co. Ltd (Biotecnologia Liuyi)oferece câmara de eletroforese horizontal para ensaio cometa. Bem-vindo a entrar em contato conosco para discutir sobre oEnsaio Cometaprotocolo.
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Horário da postagem: 20 de setembro de 2024