Preparação de Gel de Agarose para Eletroforese
Nota: Use sempre luvas descartáveis!
Instruções passo a passo
Pesando Pó de Agarose:uusar papel de pesagem e balança eletrônica para medir 0,3g de agarose em pó (baseado em sistema de 30ml).
Preparando o buffer TBST:preparar 30ml de tampão TBST 1x em um frasco Erlenmeyer de 100ml.
Dissolução de pó de agarose:pcoloque o pó de agarose no tampão TBST e agite bem.Coloque-osleve ao micro-ondas e aqueça (normalmente por 50 segundos, coberto com papel alumínio) até dissolver completamente.
Resfriando e Adicionando Nuclease:uUse luvas para retirar a mistura do micro-ondas e deixe esfriar um pouco em água fria até aquecer (aproximadamente 60°C). Adicione 2 µl de nuclease (substituto de Eb) enquanto agita para misturar bem.
Preparando o molde de gel:
- Cincline e seque obandeja de gel e dispositivo de fundição de geldo tanque de eletroforese.
- Pamarre o gelbandejano tanque interno e insira o pente em uma posição fixa.
- Misture a solução de gel de agarose, resfriada a cerca de 65°C, e despeje-a cuidadosamente sobre obandeja de gelnodispositivo de fundição de gel, espalhando lentamente até formar uma camada uniforme de gel na placa de vidro.
- Deixe descansar em temperatura ambiente até que o gel solidifique completamente.
- Remova cuidadosamente o pente verticalmente e remova a fita.
- Coloque o gelbandejano tanque de eletroforese.
Importante: Certifique-se de que não existem bolhas de ar na área dos dentes do pente. A superfície do líquido deve ser lisa e sem ondulações.
Executando o Gel
Carregando o Gel
Após o gel solidificar, coloque-o no tanque de eletroforese e despeje o tampão de eletroforese até que o gel esteja submerso.
Preparando Amostras
- Retire o marcador e o buffer de carga da geladeira.
- Adicione 6 µl de tampão de carga às amostras e misture bem.
- Utilizando uma micropipeta, carregue lentamente as amostras nos poços grandes do gel (tenha cuidado para não perfurar o gel e não dispense todo o volume para evitar bolhas de ar).
- Carregue o marcador em qualquer um dos poços pequenos (lembre-se de sua posição).
Iniciando Eletroforese
- Cubra o tanque de eletroforese e inicie a eletroforese imediatamente após carregar o gel.
- Defina a tensão para 60-100V. As amostras migrarão do eletrodo negativo (preto) para o eletrodo positivo (vermelho).
- Uma voltagem mais alta encurta o intervalo de separação eficaz do gel de agarose.
- Pare a eletroforese quando o corante azul de bromofenol atingir cerca de 1 cm da borda inferior da placa de gel.
Observando Resultados
Após separar as bandas, pare a eletroforese, retire o gel e detecte e fotografe diretamente.
Use um sistema de imagem em gel para fotografar e observar as bandas (verifique se há bandas para o marcador ou amostras).
Depois de obter o mapa da banda de gel, encontre o marcador. Com base no marcador, você pode determinar as bandas alvo!
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Horário da postagem: 09/08/2024