Várias considerações devem ser mantidas em mente ao usar eletroforese em membrana de acetato de celulose (2)

Compartilhamos várias considerações na semana passada sobre o uso da eletroforese com membrana de acetato de celulose e encerraremos este tópico aqui hoje para sua referência.

Seleção de Concentração tampão

A concentração do tampão utilizado na eletroforese em membrana de acetato de celulose é geralmente inferior à utilizada na eletroforese em papel.O pH comumente usado 8,6Bo tampão arbitral é tipicamente escolhido dentro da faixa de 0,05 mol/L a 0,09 mol/L.Ao selecionar a concentração, é feita uma determinação preliminar.Por exemplo, se o comprimento da tira de membrana entre os eletrodos na câmara de eletroforese for de 8 a 10 cm, será necessária uma tensão de 25 V por centímetro de comprimento da membrana e a intensidade da corrente deverá ser de 0,4 a 0,5 mA por centímetro de largura da membrana.Se estes valores não forem alcançados ou excedidos durante a eletroforese, a concentração do tampão deverá ser aumentada ou diluída.

Uma concentração de tampão excessivamente baixa resultará num movimento rápido das bandas e num aumento na largura da banda.Por outro lado, uma concentração de tampão excessivamente elevada retardará a migração da banda, dificultando a distinção de certas bandas de separação.

Deve-se notar que na eletroforese em membrana de acetato de celulose, uma parcela significativa da corrente é conduzida através da amostra, o que gera uma quantidade considerável de calor.Às vezes, a concentração de tampão escolhida pode ser considerada apropriada.Porém, sob condições de aumento da temperatura ambiente ou quando se utiliza voltagem mais alta, a evaporação da água devido ao calor pode se intensificar, resultando em uma concentração de tampão excessivamente alta e até mesmo causando o ressecamento da membrana.

Volume de amostra

Na eletroforese em membrana de acetato de celulose, a quantidade de volume da amostra é determinada por vários fatores, incluindo condições de eletroforese, propriedades da própria amostra, métodos de coloração e técnicas de detecção.Como princípio geral, quanto mais sensível for o método de detecção, menor poderá ser o volume da amostra, o que é vantajoso para a separação.Se o volume da amostra for excessivo, os padrões de separação eletroforética podem não ser claros e a coloração também pode ser demorada.No entanto, ao analisar quantitativamente as bandas coradas separadas utilizando métodos de detecção colorimétrica de eluição, o volume da amostra não deve ser muito pequeno, pois pode resultar em valores de absorvância mais baixos para determinados componentes, levando a erros maiores no cálculo do seu conteúdo.Nesses casos, o volume da amostra deve ser aumentado adequadamente.

Normalmente, o volume de amostra adicionado em cada centímetro da linha de aplicação de amostra varia de 0,1 a 5 μL, equivalente a uma quantidade de amostra de 5 a 1000 μg.Por exemplo, na análise rotineira de eletroforese de proteínas séricas, o volume de amostra adicionado em cada centímetro da linha de aplicação geralmente não excede 1 μL, equivalente a 60 a 80 μg de proteína.No entanto, ao analisar lipoproteínas ou glicoproteínas utilizando o mesmo método de eletroforese, o volume da amostra precisa ser aumentado de forma correspondente.

Em conclusão, o volume de amostra mais adequado deve ser selecionado com base em condições específicas através de uma série de experimentos preliminares.

Seleção da solução de coloração

As bandas separadas na eletroforese em membrana de acetato de celulose são normalmente coradas antes da detecção.Diferentes componentes da amostra requerem diferentes métodos de coloração, e os métodos de coloração adequados para eletroforese em membrana de acetato de celulose podem não ser inteiramente aplicáveis ​​ao papel de filtro.

Existem três princípios principais para escolher a solução de coloração paramembrana de acetato de celulose.Primeiramente,Os corantes solúveis em água devem ser preferidos aos corantes solúveis em álcool para evitar o encolhimento da membrana e a deformação causada pela solução corante deste último.Após a coloração, é importante enxaguar a membrana com água e minimizar a duração da coloração.Caso contrário, a membrana pode ficar enrolada ou encolhida, o que afetaria a detecção subsequente.

Em segundo lugar, é preferível selecionar corantes com forte afinidade de coloração para a amostra.Na eletroforese de membrana de acetato de celulose de proteínas séricas, o amino black 10B é comumente usado devido à sua forte afinidade de coloração para vários componentes da proteína sérica e à sua estabilidade.

Em terceiro lugar, devem ser escolhidos corantes de qualidade confiável.Alguns corantes, apesar de terem o mesmo nome, podem conter impurezas que resultam num fundo particularmente escuro após a coloração.Isto pode até mesmo desfocar as bandas originalmente bem separadas, tornando-as difíceis de distinguir.

Por último, a escolha da concentração da solução corante é importante.Teoricamente, pode parecer que uma concentração mais elevada da solução de coloração levaria a uma coloração mais completa dos componentes da amostra e a melhores resultados de coloração.No entanto, este não é o caso.A afinidade de ligação entre os componentes da amostra e o corante tem um certo limite, que não aumenta com o aumento da concentração da solução corante.Pelo contrário, uma concentração excessivamente elevada da solução corante não só desperdiça o corante como também dificulta a obtenção de um fundo claro.Além disso, quando a intensidade da cor atinge um determinado valor máximo, a curva de absorção do corante não segue uma relação linear, principalmente em medições quantitativas. Na eletroforese em membrana de acetato de celulose, a concentração da solução corante é geralmente inferior à utilizada na eletroforese em papel.

Detalhes que você deve saber sobre a biotecnologia Liuyi de Pequim's membrana de acetato de celulosetanque de eletroforese e sua aplicação em eletroforese, visite aqui:

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Referência:Eletroforese(Segunda edição) pelo Sr.